3 būdai atlikti ląstelių kultūrą - Žinios

Turinys

Žingsniai
Bendruomenės klausimai ir atsakymai
Patarimai
Dalykai, kurių jums reikės

Kiti skyriai

Ląstelių kultūra yra sudėtinga procedūra, kurią gali atlikti tik profesionalūs laboratorijos darbuotojai, nes jai reikia daug specialaus mokymo ir įrangos. Procesas apima nedidelio ląstelių mėginio paėmimą iš gyvūninio audinio ir ląstelių skatinimą daugintis. Aseptinių procedūrų pasirinkimas, idealios kultūros ir terpės pasirinkimas bei ląstelių palaikymas draugiškoje aplinkoje padeda užtikrinti gerą proliferaciją. Profesionalai pirmiausia sukuria savo darbo zoną, tada eksperimentui pasirenka geriausias ląstelių kultūros medžiagas. Po to svarbu stebėti naujai išaugintas ląsteles ir jas subkultūruoti, jei reikia tęsti procesą.

Žingsniai

1 metodas iš 3: darbo vietos paruošimas

Įrengkite aseptinę darbo zoną ir sterilizuokite savo įrangą. Apipurkškite darbinį paviršių ir ląstelių kultūros gaubto vidų 70% alkoholio dezinfekuojančiu purškikliu. Hipochloritai, fenoliai ir alkoholiai taip pat paprastai naudojami sterilizuoti įrangą laboratorijoje, tačiau patikrinkite, ar yra jūsų laboratorijoje.
- Išimkite bet kokius pašalinius daiktus iš savo darbo zonos, kad sumažintumėte netvarką. Nelaikykite daiktų toje pačioje vietoje, kur atliekate ląstelių kultūras.
- Nepamirškite palikti įjungto ląstelių kultūros gaubto ventiliatoriaus. Neišjunkite jo, nebent gaubtas nebus naudojamas ilgą laiką.
- Kreipkitės į laboratorijos vadovą, jei turite klausimų, ką naudoti sterilizuojant darbo vietą.
Nusiplaukite rankas ir užsidėkite asmenines apsaugos priemones. Plaukite rankas antibakteriniu muilu ir šiltu vandeniu. Tada užsivilkite pirštines, chalatą, akinius, kaukę ir bet kokius kitus dalykus, reikalingus jūsų eksperimentui.
- Nepamirškite susirišti plaukus, jei jie ilgi, todėl jie bus nuo kelio.
Sterilizuokite visus naudojamus reagentus, tirpalus ar kitas terpes. Tai gali reikėti naudoti autoklavą arba sterilų filtrą. Prieš bandydami ją sterilizuoti, patikrinkite naudojamų laikmenų tipo gaires.
- Sterilizavus terpę, kolba užteršiama tuoj pat.
Laikykitės sterilių procedūrų, kad išvengtumėte užteršimo. Užteršus ląstelių terpę cheminiais ar biologiniais veiksniais, eksperimentas gali būti sugadintas. Cheminiai teršalai apima ploviklius, vandenį, endotoksinus ir teršalus ląstelių kultūros terpėse. Tarp biologinių teršalų yra pelėsiai, mielės, bakterijos, virusai ir mikoplazma. Kad šių teršalų nepatektų į ląstelių kultūros terpę, visada laikykitės aseptikos.
- Pavyzdžiui, geriausia naudoti pipetę terpei perpilti į kolbą, nes pilant terpę padidėja užteršimo rizika.
Patarimas: Visada dirbkite lėtai ir apgalvotai, kad išlaikytumėte sterilią darbo vietą.

2 metodas iš 3: ląstelių, kultūros ir terpės pasirinkimas

Pasirinkite tinkamą langelį savo eksperimentams. Iš komercinių ar ne pelno siekiančių tiekėjų galite įsigyti daugybę gyvūnų ląstelių linijų. Patikrinkite, kokių tipų langeliai yra, ir pasirinkite tą, kuris geriausiai tinka jūsų eksperimentui. Norėdami padidinti sėkmingo eksperimento tikimybę, įsitikinkite, kad pasirinkote aukštos kokybės ląstelių liniją. Keletas kriterijų, kuriuos galbūt norėsite apsvarstyti, yra šie:
- Ląstelės rūšis
- Ląstelių funkcinės charakteristikos
- Nesvarbu, ar jums gali prireikti baigtinių, ar ištisinių ląstelių linijų
- Idealios augimo sąlygos ir savybės
- Nesvarbu, ar jums reikia normalių, ar transformuotų ląstelių
Įspėjimas: Niekada nebandykite kultivuoti ląstelių, paimtų iš laboratorijoje dirbančių asmenų. Netyčia įvedus šias ląsteles atgal į žmogaus kūną, gali atsirasti piktybinė liga.
Eikite su prilipusia kultūra daugeliui ląstelių tipų. Prilipusi kultūra yra dirbtinis substratas, ant kurio sluoksniuojamos ląstelės. Šio tipo kultūra geriausiai tinka daugumai gyvūnų ląstelių, nes joms daugintis reikalingas substratas. Tačiau geriausia patikrinti naudojamų ląstelių linijos specifikacijas, kad nustatytumėte, ar jums reikia tokio tipo kultūros.
- Pridėję savo terpę prie prilipusios kultūros ląstelių, pažiūrėkite į ląsteles mikroskopu, kad pamatytumėte, ar jos neišleido iš substrato. Jie bus išskleisti, jei jie išsiskirs iš pagrindo.
Pasirinkite suspensijos kultūrą ląstelėms, kurios buvo pritaikytos jai. Naudojant suspensiją, ląstelės nieko neremia. Vietoj to, jie laisvai plūduriuoja skystyje, o tai gali palengvinti kultūros išplėtimą pridedant terpės. Kai kurios ląstelių linijos buvo specialiai modifikuotos naudoti suspensijoje, todėl pasitarkite su ląstelių linijos gamintoju. Suspensijos terpė taip pat yra geras pasirinkimas nelipnioms ląstelėms.
- Atminkite, kad kasdien turėsite atlikti ląstelių skaičiavimus, jei naudojate suspensijos ląstelių kultūrą.
Pasirinkite geriausiai jūsų ląstelėms tinkančią terpę. Ideali terpė skirsis priklausomai nuo to, kokio tipo ląsteles naudojate. Kreipkitės į ląstelių linijos gamintoją, kad nustatytumėte idealią ląstelių kultūros terpę jūsų naudojamoms ląstelėms. Kai kurie įprasti tipai yra šie:
- Serumas
- Pagrindinė laikmena
- Sumažinta terpės terpė
- Žiniasklaida be serumo

3 metodas iš 3: Ląstelių stebėjimas

Patikrinkite ląstelės terpės pH ir CO2 lygį. Visų ląstelių linijose vidutinis CO2 lygis yra 4–10%. Tačiau idealus terpės pH lygis skirsis atsižvelgiant į naudojamų ląstelių tipą, todėl visada patikrinkite savo ląstelių kultūros pH lygį. Kreipkitės į ląstelių linijos gamintoją, kad gautumėte išsamios informacijos apie idealų pH lygį, arba naudokite įprastus rekomenduojamus pH lygius jūsų naudojamų ląstelių tipams.
- Pavyzdžiui, žinduolių ląstelės geriausiai auga, kai jų pH yra 7,4, tačiau vabzdžių ląstelės geriausiai auga, kai jų pH yra 6,2.
Reguliuokite temperatūrą, kad pasiektumėte optimalią aplinką. Kai kurios ląstelės klestės tik siaurame temperatūros diapazone, o kitos ląstelės gali klestėti platesniame temperatūrų diapazone. Apsvarstykite naudojamų ląstelių tipą ir sureguliuokite aplinkos temperatūrą, kurioje ląstelės laikomos idealiu lygiu. Kai kurios įprastos temperatūros rekomendacijos:
- Žmogaus ir žinduolio ląstelės - nuo 36 iki 37 ° C (nuo 97 iki 99 ° F)
- Vabzdžių ląstelės - 27 ° C (81 ° F)
- Paukščių ląstelės - 38,5 ° C (101,3 ° F)
- Šaltakraujiškos ląstelės - nuo 15 iki 26 ° C (nuo 59 iki 79 ° F)
Skaičiuokite ląsteles hemocitometru iškart po to, kai pradėsite kultūrą. Hemocitometras yra į tinklelį panašus lęšis, kuris mikroskopu eina per ląstelių viršų. Tai leidžia lengviau suskaičiuoti ląsteles suskaidant ląsteles į kvadratus ir kitus mažesnius segmentus.
- Hemocitometre būtinai įrašykite ląstelių skaičių kiekviename tinklelyje, kad galėtumėte nustatyti, ar kitą kartą jas skaičiuojant ląstelės dauginasi.
Patarimas: Naudokite spaustuką, kad būtų lengviau stebėti ląstelių skaičių kultūroje.
Subkultūruoja ląsteles, kai jos padvigubėja. Po to, kai terpėje ląstelių skaičius padvigubėjo, galite jas subkultūruoti, kad tęstumėte jų augimą, padalindami ląsteles į 2 talpyklas ir į kiekvieną pridedant šviežios terpės. Naudokite to paties tipo substratą ar suspensijos terpę, kurią naudojote pradinei ląstelių kultūrai.
- Ląsteles padalinkite į 2 kolbas taip, kad kiekvienoje būtų po pusę, tada į indą įpilkite 3 dalis naujos terpės, kad terpė būtų 25% senos ir 75% naujos.